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INTERVISTA - All'origine dei segreti della vita con le cellule germinali primordiali (part. II)

Se nella prima parte dell'intervista il professor De Felici ha spiegato l'origine e l'importanza delle cellule germinali primordiali, in questa seconda parte si è soffermato sulla sperimentazione e sul futuro della ricerca in questo specifico settore

» Ricerca in Medicina Valerio Rossini - 08/10/2012

Cellule germinali primordiali e queste sconosciute. Nella prima parte di questa lunga ma interessante intervista, dedicata ad un argomento senza dubbio affascinante, il professor Massimo De Felici si è soffermato a lungo sulla loro origine, la loro struttura e le loro caratteristiche fondamentali, nonché al loro studio. In questa seconda parte, invece, il docente ordinario di Istologia presso la Facoltà di Medicina e Chirurgia dell'Università di Roma 'Tor Vergata', cerca di far comprendere come si struttura e come avviene la fase di ricerca legata allo studio di queste cellule per poi concludere con un'analisi sul futuro della ricerca stessa e, perché no, di qualche altro sogno nel cassetto:

Professor De Felici, dopo tutti questi anni di studio intenso sulle cellule germinali primordiali che lei e altri avete portato avanti, ci sono ancora degli obiettivi che vi prefiggete di raggiungere?
"Ovviamente sì, in particolare ho due sogni nel cassetto: il primo è riuscire ad ottenere una linea 'immortalizzata' di PGC, come si fa per altri tipi di cellule, inserendo in esse geni che le inducano a rimanere proliferanti senza differenziare e senza trasformarsi in cellule EG. Ne io, ne altri, a quanto mi risulta, siamo mai riusciti in questo intento. Avere a disposizione quella che noi chiamiamo 'una linea cellulare immortalizzata' di PGC darebbe grandi vantaggi ai nostri studi e eviterebbe di continuare ad isolare queste cellule con grande fatica dagli embrioni".

E qual è il suo secondo sogno nel cassetto?
"È ottenere in vitro, partendo da cellule staminali, milioni di PGC (noi dagli embrioni ne possiamo isolare con grande fatica poche migliaia!), in grado di dare origine ad ovociti e crescere questi fino allo stadio di maturazione necessaria per essere fecondati. Molti laboratori in questi ultimi anni hanno riportato che è possibile partendo da diversi tipi di cellule staminali, produrre in vitro cellule che mostrano caratteristiche molto simili alle PGC e perfino ovociti e spermatozoi. Tuttavia, molti aspetti di questi esperimenti sono da chiarire e rimangono controversi. Ammesso di riuscire a produrre PGC completamente funzionali dalle cellule staminali in coltura (questo sarebbe già un gran risultato!), le difficoltà da superare per produrre ovociti maturi in vitro sono ancora molto grandi. Appare relativamente più semplice generare da cellule staminali, PGC che possono diventare spermatozoi, piuttosto che ovociti maturi. In particolare, mentre come ho accennato sopra, sappiamo come produrre ovociti dalle vere PGC, sappiamo ancora molto poco su come indurre un ovocita a formare in vitro un follicolo, ovvero l'associazione con cellule chiamate cellule follicolari, che deve contenerlo per tutta l'ovogenesi e che sembra essere indispensabile per la sua maturazione. Recenti risultati ottenuti da noi e da altri suggeriscono che la via da seguire per riprodurre questo processo è probabilmente il trapianto, in un ovaio, delle PGC o degli ovociti prodotti in vitro piuttosto che continuare la loro coltura in vitro. A me interessa soprattutto l’aspetto biologico e di ricerca di base di queste ricerche, ma si potrebbero aprire scenari di applicazione clinico-mediche vastissimi, compresi quelli che sconfinano nelle questioni etiche e morali".

Dunque quali sono le difficoltà maggiori nello studio del passaggio da cellula staminale a PGC?
"Sicuramente una della maggiori difficoltà è quella di riuscire a distinguere fra loro questi due tipi cellulari: infatti non si possono distinguere sulla base della morfologia ed entrambi esprimono praticamente gli stessi marcatori molecolari. Io dico sempre che l'unico modo sicuro è quello di verificare se la presunta PGC sia in grado di iniziare la meiosi in coltura o magari dopo trapianto in un ovaio. Come ho sopra accennato, nel nostro laboratorio sappiamo come indurre una vera PGC ad iniziare la meiosi differenziando in un ovocito, una presunta PGC ottenuta da una cellula staminale dovrebbe avere lo stesso comportamento. Ma è poi proprio vero che per formare un ovocito o uno spermatozoo da una cellula staminale bisogna necessariamente passare attraverso una PGC funzionale? È proprio vero che la formazione di un follicolo è indispensabile per la maturazione di un ovocito?  Spero che i prossimi anni daranno delle risposte a questi dubbi che a volte mi assalgono quando leggo lavori che descrivono la formazione di ovociti e di spermatozoi con la coda in coltura a partire da cellule staminali".

Finora abbiamo parlato di ricerche effettuate su topolini conoscendo le loro similitudini con l'essere umano: ad oggi è possibile attivare sperimentazioni sull'uomo?
"Dato che nell'embrione umano le PGC si formano verso la fine della terza settimana e arrivano nelle gonadi tra la quarta e la sesta settimana di sviluppo embrionale non si può pensare ad una sperimentazione sistematica. Comunque dagli sporadici studi fatti su embrioni abortiti di questa fascia di età da diversi gruppi nel mondo, si evince che il comportamento delle PGC umane, sia a livello cellulare che molecolare è molto simile a quello delle PGC murine, ossia dei topolini. Il modello murino sembra essere in questo caso molto vicino all'umano. La possibilità di produrre in vitro cellule simili o uguali alle PGC di cui ha parlato prima a partire da vari tipi di cellule staminali anche nell'uomo apre nuove prospettive per studi più approfonditi".

Esiste un margine d'errore nello studiare in vitro questi processi molecolari che dovrebbero avvenire in vivo? Quanto si rischia di credere erroneamente che quel processo segua determinati parametri solo perché lo si è studiato in vitro, quando magari in vivo la situazione cambia?
"Di certo questo rischio esiste sempre e quando possibile un risultato ottenuto in vitro andrebbe sempre confermato in vivo. D'altro canto gli approcci sperimentali in vitro, ci aiutano moltissimo a comprendere molti aspetti di processi molecolari che sarebbe molto difficile, e a volte impossibile, studiare nel complesso contesto di un organismo. Prima per esempio facevo riferimento all'impossibilità di studiare in vivo i meccanismi che controllano la formazione e lo sviluppo delle PGC umane dato che bisognerebbe utilizzare embrioni di poche settimane".

Ci sono altri "hot spots" attualmente in fase di studio che riguardano le PGC?
"Assolutamente sì. Uno dei campi di ricerca più 'hot' in questo momento è quello dell'epigenetica. Ovvero capire come modificazioni del DNA che non riguardano la sequenza dei nucleotidi (le molecole che formano il DNA), e degli istoni, le proteine intorno alle quali si arrotola il DNA, modifichino l’attività dei geni. È certo che queste modificazioni svolgono un ruolo importante nella 'riprogrammazione genomica' di cui ho parlato prima, ma anche per un corretto sviluppo embrionale, per il differenziamento cellulare e nell'insorgenza di certe patologie, tra cui i tumori. Ebbene, ancora una volta le PGC, per le ragioni che ho cercato di spiegare prima e per un altro aspetto che spiegherò ora, sono in prima linea in  questi studi. Poco prima del loro differenziamento, nelle PGC si attivano meccanismi molecolari che cancellano tutte le modificazioni epigenetiche, che sono avvenute nel genoma dei genitori dell’embrione e che riguardano un piccolo, ma molto importante gruppo di geni, i cosiddetti geni 'imprintati'. Nessuno sa ancora con precisione come si attivino e quali siano i meccanismi che causano questa cancellazione. Noi recentemente, in collaborazione con un gruppo di biologi molecolari della Sapienza, abbiamo cominciato a studiare questo processo e abbiamo trovato che un enzima chiamato PARP svolge un ruolo importante in questo processo".

Professore ma che cosa vuol dire geni "imprintati" e perché questo processo è importante?
"Un gene 'imprintato' è un gene il cui il DNA ha subito una modificazione epigenetica dovuta a numerose metilazioni (aggiunta di gruppi –CH3), in citosina (una dei quattro nucleotidi che formano il DNA), in una regione critica per l'attività del gene e che in genere ne inibiscono l'espressione. Sono modificazioni che si verificano in un piccolo numero di geni (circa 50-80 dei circa 30mila presenti in una cellula umana), durante il periodo dello sviluppo delle cellule germinali che segue quello delle PGC e si completa nell'ovocito e nello spermatozoo maturi. Queste modificazioni vengono trasmesse, inalterate, in tutte le cellule somatiche di un nuovo individuo che nascerà dalla fusione delle cellule germinali protagoniste della fecondazione, l'ovocito e lo spermatozoo. Durante lo sviluppo embrionale, tuttavia, nelle PGC l' "imprinting" viene cancellato, per poter essere poi impresso di nuovo nel proseguo dello sviluppo delle cellule germinali. Non è chiaro quale sia il significato di questo processo. Certamente una sua conseguenza è che alla fecondazione il genoma materno, quello dell'ovocito, e quello paterno, quello dello spermatozoo, non sono equivalenti. Un embrione si può sviluppare normalmente solo se possiede entrambi i genomi. Ci sono poi altre importanti e complesse implicazioni dell'imprinting che riguardano per esempio anche i tumori, ma non vorrei dilungarmi oltre".

E cos'altro puo' dirci rispetto i campi di ricerca? 
"Un secondo campo di ricerca che ci vede in qualche modo coinvolti è quello della neo-ovogenesi. Per capire di cosa si tratta, devo spiegare prima alcune cose. Un cosiddetto 'dogma' della biologia della riproduzione è che una donna nasce con un numero di ovociti definito alla nascita. Questo numero è stabilito da due processi: la proliferazione delle PGC e la seguente degenerazione degli ovogoni e degli ovociti che derivano dalle PGC che si verifica prima e subito dopo la nascita. Terminate queste fasi nelle due ovaie di una bambina appena nata, rimangono all'incirca complessivamente un milione di ovociti, ognuno racchiuso all'interno di un follicolo. Da questo momento in poi il numero degli ovociti prenderà a diminuire a causa di processi degenerativi, sulle cui cause e meccanismi si conosce ancora molto poco. Di fatto alla pubertà il numero di follicoli rimasto è più che dimezzato e per i successivi anni di vita fertile della donna, continuerà a diminuire fino ad esaurirsi quasi completamente in menopausa; di fatto la menopausa è causata dall'esaurimento dei follicoli nelle ovaie. Al contrario di altri tessuti dove grazie alle cellule staminali, nuove cellule possono essere continuamente prodotte per rimpiazzare quelle che muoiono, cosa che accade anche nei testicoli, dove nuovi spermatozoi vengono continuamente prodotti, nelle ovaie post natali si pensava, e molti per la verità continuano ancora a pensarlo, che gli ovociti perduti non potessero essere rimpiazzati per la mancanza di cellule staminali in grado di generare nuovi ovociti". 

E ci sono studi in merito circa il concetto di neo-ovogenesi?
"Alcuni recenti risultati suggeriscono che questo concetto debba essere rivisto e che in realtà anche nelle ovaie adulte ci siano delle cellule staminali in grado di dare origine a nuovi ovociti. Noi pensiamo che queste cellule staminali, se veramente esistono, potrebbero essere delle PGC rimaste indifferenziate e vorremmo verificarlo. Sarebbe una specie di rivoluzione nel campo. Fino ad oggi, tutti ritenevamo che le PGC esistono solamente nell'embrione e che il loro destino è quello di formare ovociti solamente durante il periodo embrionale. Sfortunatamente la ricercatrice alla quale avevo affidato questa linea di ricerca, ci ha lasciato per andare a lavorare in Inghilterra visto che qui da noi non vi erano possibilità di continuare la sua ricerca. Purtroppo, come si sa, questo è uno dei problemi maggiori che affligge da tempo la ricerca in Italia".

Questa non ci voleva. Ma ricapitolando come possiamo sintetizzare questo nostro lungo viaggio nelle PGC?
"Ovviamente le PGC sono per me le cellule più importanti del nostro corpo anche se si trovano solamente nell'embrione. Nonostante la loro grande importanza, sono cellule ancora poco conosciute, specie ai non addetti ai lavori, ma a volte anche dagli esperti di riproduzione. Basti pensare che in Italia vengono studiate solamente nel mio laboratorio e in Europa ci saranno al massimo quattro o cinque laboratori che le studiano. Studiare queste cellule significa fare un viaggio alle origini dei segreti della vita e affrontare un po' tutti i maggiori problemi della biologia: la riproduzione sessuale, la meiosi, la migrazione e la proliferazione cellulare, l'epigenesi, la staminalità, l'origine dei tumori e i meccanismi che controllano la morte cellulare, chiamata apoptosi. A proposito di apoptosi, avrei da raccontarvi di un'altra linea di ricerca molto interessante sull'apoptosi negli ovociti che stiamo conducendo da qualche anno con risultati molto interessanti. Ma di questo credo sia meglio parlar nella prossima intervista!"


Certamente. Ringraziamo moltissimo il professor Massimo De Felici per le esaurienti spiegazioni. Nella prossima intervista parleremo, dunque, dell' 'apoptosi', una delle tematiche centrali nelle attuali ricerche di biologia molecolare.