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INTERVISTA - All'origine dei segreti della vita con le cellule germinali primordiali (part. I)

Parlare di "cellule staminali" vuol dire a volte generare confusione e imprecisioni su un argomento tanto affascinante quanto complesso. In questa intervista il professor De Felici delinea luci ed ombre di questo argomento, allontanandone falsi miti

» Ricerca in Medicina Valerio Rossini - 08/10/2012

Sono tra le cellule più famose nel mondo dell'informazione scientifica e non solo. Eppure, quando si parla di "cellule staminali", tra i cosiddetti "laici", quindi tra coloro che per professione sono lontani da tutto ciò che riguarda la biologia cellulare e di laboratorio, si genera spesso una grande confusione, soprattutto per la grande quantità di sfumature che si legano a questo tema scientifico. Così, per cercare di approfondire l'argomento, NanniMagazine.it ha parlato a lungo proprio con il professor Massimo De Felici, ordinario di Istologia presso la Facoltà di Medicina e Chirurgia dell'Università di Roma 'Tor Vergata'. Inoltre per cercare di favorire la lettura di un tema tanto affascinante quanto complesso, il contenuto emerso durante l'intervista è stato diviso in due parti: la prima dedicata all'origine delle cellule germinali primordiali, la loro struttura ed il loro studio, la seconda centrata più sull'aspetto della sperimentazione e sul futuro della ricerca in questo specifico settore scientifico:

Professor De Felici, il suo laboratorio si occupa delle cellule germinali primordiali: di cosa si tratta esattamente?
"Intanto vorrei ringraziarvi dell'opportunità che mi date di parlare delle mie cellule preferite e di fare un po' di divulgazione scientifica. Spesso i nostri studenti e la gente comune si chiede cosa fanno rinchiusi nei loro laboratori i ricercatori nelle Università. Le notizie che trapelano attraverso i mass media sono spesso imprecise e a volte fuorvianti. Penso che un po' di semplice divulgazione della scienza sia veramente necessaria. Detto questo, voglio dire che mi occupo da circa trent'anni di gametogenesi (formazione delle cellule germinali, ovvero di ovociti e spermatozoi), in particolare dello sviluppo delle cellule germinali primordiali o PGC ('primordial germ cell') dei mammiferi. Le PGC sono le cellule che nell’embrione danno origine ai gameti a seconda del sesso, femminili o maschili. Nel nostro campo le definiamo le 'madri di tutte le cellule staminali'".

Qual è la loro importanza che rapporto hanno con  altre tipi di cellule staminali?
"Innanzitutto, come ho già detto, sono cellule destinate a diventare le cellule germinali da cui derivano lo spermatozoo e l'ovocito dell'adulto, ovvero le due cellule che fondendosi al momento della fecondazione danno origine allo zigote, la prima cellula dell'embrione, ovvero la cellula "capostipite o staminale" di tutte le cellule di un individuo. Basterebbe questo per capire la loro importanza. Tuttavia, per comprendere l'importanza delle PGC nel campo delle cellule staminali è necessario spiegare alcuni concetti un po' più complessi. Per poter dare origine a tutte le cellule di un nuovo individuo, il genoma[2] dello zigote deve possedere una struttura del tutto unica. A differenza del genoma di tutte le cellule specializzate del corpo di un adulto, come i neuroni o le cellule muscolari in cui sono attivi i relativamente pochi geni necessari alla sopravvivenza e al funzionamento della cellula, il genoma dello zigote è strutturato in modo 'plastico', tale cioè da consentire che possano essere attivati nel corso dello sviluppo tutti i geni necessari alla formazione dei diversi tipi cellulari. Noi chiamiamo questa proprietà "totipotenza del genoma". È qui che entrano in gioco le PGC in quanto la totipotenza del genoma comincia ad essere stabilita durante la loro formazione e sviluppo. I diversi tipi di cellule staminali possiedono tutte una più o meno ampia plasticità del genoma chiamata' pluripotenza o multipotenza' che le rende in grado di dare origine a pochi o molti tipi cellulari diversi. In qualche modo la plasticità del genoma sembra essere in rapporto anche con la seconda straordinaria proprietà delle cellule staminali, almeno di alcuni tipi di esse, la capacità di 'autoriprodursi' senza differenziare per tempi molto lunghi, a volte per l'intero arco di vita di un individuo. Come viene stabilita, perduta ed eventualmente riacquisita la plasticità del genoma durante la vita di una cellula, rimane in gran parte un mistero, ma alcuni meccanismi molecolari responsabili di questi processi sono stati svelati proprio grazie a studi condotti sulle cellule germinali primordiali".

Da quanto tempo è operativo il suo laboratorio e in che modo si svolgono gli studi su queste cellule?
"Nel 1981, pochi anni dopo la laurea, ho cominciato a studiare le PGC a Londra in un laboratorio del Mammalian Research Council (MRC) diretto da una delle più grandi figure nel campo della biologia della riproduzione degli ultimi cinquanta anni, la compianta Anne McLaren. Il mio progetto prevedeva la messa a punto di metodi per l'isolamento e la coltura in vitro (al di fuori dall'embrione) delle PGC di embrioni di topo allo scopo di cominciare a cercare di carpirne i segreti molecolari. Le PGC erano state identificate negli embrioni di molte specie di mammiferi già dai primi anni del novecento, il 2011 è stato il centenario delle prime descrizioni delle PGC negli embrioni umani; nulla si sapeva, tuttavia, dei meccanismi che controllano la loro formazione e sviluppo. Io avevo già lavorato per alcuni anni nel laboratorio del professor Gregorio Siracusa, all'ateneo de La Sapienza, dove avevo appreso le basi per la manipolazione e la coltura delle cellule germinali, ma isolare poche centinaia di cellule da un embrione era un po' come cercare un ago in un pagliaio. Allora non vi erano le sofisticate tecnologie di isolamento cellulare disponibili oggi e l'impresa appariva piuttosto ardua". 

Quindi come si è deciso di procedere nella ricerca?
"Sfruttando la possibilità di riconoscere le PGC con una colorazione specifica e la loro diversa 'densità' rispetto a quella delle altre cellule, così riuscimmo a mettere a punto un metodo per isolarle dalle gonadi embrionali. I primi esperimenti di coltura risultarono però, in un quasi completo fallimento: utilizzando i più diversi mezzi e condizioni di coltura, la maggior parte delle PGC, specie quelle meno differenziate, moriva dopo poche ore dall’isolamento dall'embrione. Ipotizzammo che esse, come molti altri tipi di cellule embrionali, avessero bisogno, per sopravvivere, di specifici fattori proteici chiamati fattori di crescita, che in vivo vengono forniti dal microambiente. Ma quali erano e come identificare questi fattori? Tornando a Roma, a partire dal 1983 continuai le mie ricerche, che negli anni hanno portato me e i miei collaboratori, a mettere a punto metodi di isolamento e coltura delle PGC sempre più efficienti. Oggi posso dire, con un po' di orgoglio, questi metodi o loro modificazioni vengono utilizzati nei laboratori, che sempre più numerosi hanno preso a studiare queste affascinanti cellule. Gli stessi metodi sono stati utilizzati con successo per isolare e coltivare anche PGC umane".

Una bella sfida: 
"Vede, per diversi anni ho lavorato praticamente da solo, sempre nel laboratorio del professor Siracusa, prima alla Sapienza e poi a Tor Vergata, discutendo i miei risultati con lui e Anne McLaren e procedendo con pochissimi finanziamenti a disposizione. Solamente dopo alcuni anni, trasferitomi a Tor Vergata, ho cominciato ad essere affiancato da qualche dottorando, e solo da pochi anni da un paio di ricercatori. Attualmente il mio gruppo è formato da due ricercatrici e una dottoranda. Se si pensa che i gruppi più importanti, che nel mondo studiano le PGC, sono formati da diversi ricercatori e possono contare su sostanziosi finanziamenti, la nostra è stata e riamane una bella sfida! Nonostante questo, se andate sul 'database' di Pub Med, potete verificare che il mio gruppo è forse quello che ha pubblicato più lavori sulle PGC del mammifero negli ultimi venti anni. Scusate il piccolo sfogo, ma chi mi conosce sa che non uso incensarmi".

Professor De Felici quali sono stati gli sviluppi e le scoperte più importanti derivati da questi studi?
"Non è facile riassumere brevemente i risultati di decine forse centinaia di esperimenti. Per esempio, abbiamo scoperto che la ragione principale per cui le PGC morivano in coltura era che esse per sopravvivere, moltiplicarsi e differenziare in ovociti o spermatogoni, hanno effettivamente bisogno di essere continuamente stimolate da diversi fattori di crescita, tra cui voglio ricordarne due tra quelli meglio caratterizzati da noi, il LIF (Leukemia Inhibitory Factor) e l'SCF (Stem Cell Factor). I metodi di isolamento e coltura delle PGC hanno permesso di ottenere importanti informazioni sui meccanismi che ne controllano la formazione e lo sviluppo; cosa estremamente importante nell'ambito della biologia della riproduzione. Le PGC si formano lontano dalle gonadi (i futuri testicoli e ovaie) e migrano successivamente al loro interno, dove si differenziano. Grazie soprattutto a studi condotti nel laboratorio del mio collega Azim Surani a Cambridge (UK), si è scoperto che le PGC nell'embrione dei mammiferi, originano in stadi molto precoci dello sviluppo, da un piccolo numero di cellule embrionali in cui vengono inibiti tutti i programmi di differenziamento, eccetto ovviamente quello dello sviluppo delle PGC. Si pensa che l'inibizione di questi programmi, porti le PGC a riacquisire la totipotenza genomica con meccanismi simili a quelli che controllano la pluri/multipotenza delle cellule staminali. Nel nostro laboratorio abbiamo contribuito a questi risultati dimostrando per esempio, insieme ad altri, che il fattore di crescita BMP4 (bone morphogenic protein 4), è uno dei principali responsabili della formazione delle PGC dalle cellule embrionali. Un importante risultato che abbiamo raggiunto dopo innumerevoli tentativi, grazie soprattutto alla tenacia e alla bravura della mia collaboratrice Donatella Farini, è stato poi quello di ottenere la formazione di ovociti da PGC in coltura. Infine, per tornare ai rapporti tra PGC e cellule staminali, una fondamentale scoperta fatta negli Stati Uniti è stata che le PGC possono dare origine in coltura alle cosiddette cellule germinali embrionali (EG)".

E che cosa sono le cellule EG?
“Durante il normale sviluppo le PGC non manifestano la plasticità del loro genoma, ed anzi quando differenziano in ovociti e spermatogoni, questa sembra momentaneamente perduta. Tuttavia, alcuni anni fa’, una serie di ricercatori hanno scoperto che se le PGC di topo vengono coltivate per diversi giorni, in continua presenza di alcuni degli stessi fattori che ne sostengono la sopravvivenza e la proliferazione, si trasformano in cellule che essi hanno chiamato germinali embrionali (EG). Queste cellule possiedono le due principali caratteristiche delle classiche cellule staminali, si auto-duplicano indefinitamente e possono essere indotte a differenziare, in ogni tipo di tessuto. Si pensa che questo fenomeno, riprodotto poco dopo anche in PGC umane, sia dovuto al prolungarsi di segnali sulle PGC da parte di fattori di crescita, che se permangono possono deregolarne il differenziamento. Questo spiegherebbe la formazione di certi tumori (germinomi), che si conosce, o si sospetta, originare da PGC non correttamente differenziate, in certi tessuti subito dopo la nascita e forse l’origine di altri tipi di tumori da cellule staminali nell’adulto. Il discorso si farebbe troppo lungo e complesso, ma ho voluto riportare questi risultati come esempi dell’ampiezza di interessi e problematiche che ruotano intorno alle PGC”.

Può farci un esempio di questa "trasformazione"?
"Si è capito, per esempio, che i teratomi che possono comparire nei testicoli dei bambini dopo la nascita, sono dovuti con ogni probabilità, al mancato differenziamento delle PGC, che percorrono per sbaglio quella strada riprodotta artificialmente in coltura, quando esse sono indotte a diventare cellule EG. Ci sono alcuni miei colleghi che hanno formulato l'ipotesi che molti tipi di tumori dell’adulto siano dovuti all'errato sviluppo embrionale delle PGC, che non migrano correttamente nelle gonadi, e che rimangono indifferenziate e latenti in alcuni tessuti per poi avere evoluzione neoplastica".

E qual è la sua opinione in proposito?
"Io sono ovviamente un 'fan' delle PGC e un possibilista per natura, ovvero non mi sento di escludere a priori nessuna ipotesi ragionevole".

Professore, come è possibile che cellule già indirizzate verso una linea di differenziamento come le PGC possano "regredire" di nuovo allo stato di cellule staminali totipotenti?
"Questa è una bella domanda! Probabilmente lo stato del genoma delle PGC che si stabilisce durante la fasi iniziali del loro sviluppo, le rende soggette a questo tipo di trasformazione, quando vengono stimolate da certe condizioni ambientali o fattori di crescita. Si tratta di quello che oggi gli studiosi delle cellule staminali chiamano 'la riprogrammazione del genoma'. Cerco di spiegarmi facendo riferimento agli esperimenti di un gruppo di ricercatori giapponesi, guidati da Shinya Yamanaka, che hanno rivoluzionato il campo delle cellule staminali. Nel 2006 questi ricercatori hanno dimostrato che cellule completamente differenziate, come i fibroblasti della pelle, possono essere trasformate in cellule staminali totipotenti, se vengono forzatamente indotte ad esprimere quattro proteine con funzione di fattori di trascrizione, ovvero in grado di regolare l'attivazione o l'inibizione di gruppi di geni, che loro normalmente non esprimono. Queste proteine sono OCT4, SOX2, KLF4 e c-Myc; le PGC esprimono già elevati livelli di due di queste proteine, OCT4, SOX2 e quando sono stimolate in coltura nelle condizioni in cui si trasformano in cellule EG prendono ad esprimere anche le altre due ovvero KLF4 e c-Myc".
 

NOTE
[1]
La 'gametogenesi' è la formazione delle cellule germinali, ovvero di ovociti e spermatozoi), in particolare dello sviluppo delle cellule germinali primordiali o PGC (primordial germ cell') 
[2] Il 'genoma' è l'insieme delle molecole di DNA che si trovano nel nucleo, responsabile dei caratteri ereditari di un individuo